阿莫西林（Amoxicillin）又稱羥氨芐青霉素，CAS No. 26787-78-0，是一種常用的青霉素類廣譜β-內酰胺類抗生素，在高溫、光照、酸、堿和氧化等條件下不穩定。臨床上證實阿莫西林的聚合物會引起過敏反應，所以在生產和貯存過程中產生的有關物質，直接影響產品質量和臨床用藥的安全性。
在《中國藥典》2020 版中分析阿莫西林有關物質時，采用高效液相色譜紫外檢測器法，流動相為磷酸二氫鉀溶液和乙腈。由于流動相中含有不揮發性磷酸鹽，該方法不能直接進行質譜分析。因此，本方法采用在線柱切換二維液相色譜，將一維目標雜質峰通過閥切換轉入二維色譜柱，并進行在線脫鹽，然后采用質譜兼容的流動相，實現質譜定性分析。
圖1 阿莫西林結構式（MW 365.4）
儀器系統：
Leaps 二維液相色譜系統（雙三元泵P60、自動進樣器A10C、標配兩個二位六通閥柱溫箱C10V2、紫外檢測器D10）
Chromai三重四級桿質譜儀（TQ5000）
圖2 Chromai液相色譜-質譜聯用儀（TQ5000）
液相色譜條件：
一維色譜柱：Lotus ACC4 4.6×250 mm, 5 μm
二維色譜柱：Lotus AQ-C18 4.6×250 mm, 5 μm
一維流動相A：[0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（2 mol/L氫氧化鉀調節pH 至 5.0）]：乙腈=99：1
一維流動相B：[0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（2 mol/L 氫氧化鉀調節pH 至 5.0）]：乙腈=80：20
二維流動相A：0.1%甲酸水
二維流動相B：乙腈
柱溫：35 ?C
流速：1.0 mL/min
Loop環體積：1000 µL
進樣體積：50 µL
檢測波長：254 nm
質譜參數：
電離源：ESI源
掃描模式：
Q1全掃描：正離子模式，m/z: 200-1200
負離子模式，m/z: 80-500
子離子掃描：m/z: 100-400，標準分辨率，CE 10 V，CAD 8
離子源溫度：550 ℃
輔助加熱氣：50 psi
霧化氣：40 psi
氣簾氣：40 psi
樣品前處理：
稱取阿莫西林20.0 mg，加入一維流動相A超聲溶解并定容至10.0 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，待分析。
結果與討論：
阿莫西林雜質在一維及二維色譜的保留時間見表1，分析時將一維色譜中目標峰收集到Loop環中，再次切閥把目標峰轉移至二維色譜柱中，0-10min切至廢液實現在線脫鹽，10.1min開始切入質譜進行定性分析（見圖3）。
表1 二維液相保留時間和柱溫箱六通閥切閥時間
一維色譜峰峰號 | 2 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
一維保留 時間/min | 7.742 | 25.842 | 28.905 | 30.946 | 33.545 | 34.259 |
二維保留 時間/min | 12.345 | 12.427 | 12.544 | 14.043 | 13.662 | 13.767 |
圖3 二維液相色譜質譜聯用示意圖
色譜圖
如圖4所示，一維色譜圖中1、2、4、5、6、7、8、9、10、11、12號峰為雜質峰，3號峰為阿莫西林主成分。
圖4 二維液相色譜中一維色譜圖
質譜圖
雜質在質譜上的母離子與特征碎片離子分別如下圖所示，根據碎片離子與參考文獻，可初步推測鑒定阿莫西林中各雜質成分。
圖5 各編號雜質峰提取離子流圖（提取偏差0.5）
表2 各編號雜質峰全掃描與子離子掃描結果匯總
色譜峰編號 | 正離子全掃描m/z | 子離子碎片m/z | 負離子全掃描m/z |
2 | 384.35 | 367.85 323.80 229.60 189.55 | 382.25、338.20 |
5 | 340.25 | 323.70 229.35 189.25 | 338.20 |
6 | 340.25 | 323.70 229.50 189.45 | 338.30 |
7 | 366.30 | 207.50 160.45 | 364.25、410.25 |
8 | 366.25、731.50 | 396.95 366.85 339.65 311.85 160.25 | 729.35 |
9 | 366.45、731.60 | 396.95 366.90 339.70 311.80 160.30 | 729.55 |
根據表2結果，通過與文獻對比，推測如下：2號峰雜質可能為amoxicilloic acid (5S,6R)或amoxicilloic acid (5R,6R) [1, 2]；5號峰與6號峰具有一致的質譜碎片，應互為同分異構體，可能為amoxilloic acid (5S)或amoxilloic acid (5R) [1, 2]；7號峰與阿莫西林主成分具有一致的質荷比，應互為同分異構體，可能為L-amoxicillin, amoxicillin (5R) piperazine-2′,5′-dione或amoxicillin (5S) piperazine-2′,5′-dione [1, 2]；8號峰與9號峰具有一致的質荷比，且質譜碎片基本一致，推測該雜質為阿莫西林二聚體[2]。
結論
本方案使用科諾美特色的雙三元泵，采用在線柱切換二維液相與質譜聯用的方式，可以對一維色譜分析洗脫出來的目標化合物，通過閥切換轉移至Loop環，然后通過另一個泵把Loop環中的洗脫液轉移至二維色譜柱上，實現在線脫鹽后，立即進行質譜分析。該方法可以快速地對阿莫西林中6 個微量目標雜質進行定性分析，并通過二級質譜的裂解分析，實現相關的結構鑒定，為阿莫西林原料藥進行質量控制提供參考。
參考文獻
[1]NäGELE E, MORITZ R. Structure elucidation of degradation products of the antibiotic amoxicillin with ion trap MS
and accurate mass determination by ESI TOF [J]. J Am Soc Mass Spectr, 2005, 16(10): 1670-6.
[2]VALVO L, CIRANNI E, ALIMENTI R, et al. Development of a simple liquid chromatographic method with UV and mass spectrometric detection for the separation of substances related to amoxicillin sodium [J]. J Chromatogr A, 1998, 797(1-2): 311-6.
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