膠帶剝離與冷凍切片組合技術(shù)如何助力離體人體皮膚藥物組織分布實(shí)驗(yàn)

膠帶剝離與冷凍切片組合技術(shù)如何助力離體人體皮膚藥物組織分布實(shí)驗(yàn)

在制藥研發(fā)領(lǐng)域，準(zhǔn)確把握藥物經(jīng)皮滲透規(guī)律與皮膚層內(nèi)分布特征，可為配方優(yōu)化、滲透機(jī)制研究及臨床風(fēng)險(xiǎn)評估提供重要數(shù)據(jù)支持。本文將詳細(xì)介紹一套經(jīng)優(yōu)化的體外研究方法，該方法結(jié)合膠帶剝離與冷凍切片技術(shù)，并通過紅外光密度測定，可精準(zhǔn)分析藥物在角質(zhì)層（SC）和深層皮膚組織（deeper skin layer）中的分布情況，為藥企研發(fā)人員提供實(shí)用的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

研究背景與意義

皮膚作為人體最大的器官，既是藥物經(jīng)皮給藥的重要屏障，也是藥物發(fā)揮局部或全身作用的關(guān)鍵靶標(biāo)。過去幾十年間，眾多研究方法被開發(fā)用于探究藥物的經(jīng)皮轉(zhuǎn)運(yùn)（滲透，permeation）和在不同皮膚層中的分布（浸透，penetration）。這些數(shù)據(jù)對于藥物侵襲性評估、生物利用度測算、安全性評價(jià)以及化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評估等實(shí)驗(yàn)而言，具有非常大的價(jià)值。

對于正確研究藥物皮膚深度分布，有兩個關(guān)鍵數(shù)據(jù)：需要知道每個樣本剝離的皮膚角質(zhì)量；要知道每個樣本中所含藥物的量。根據(jù)這兩個數(shù)據(jù)，可以計(jì)算出角質(zhì)層深度和歸一化藥物濃度（樣本單位皮膚體積中的藥物量）。

傳統(tǒng)上，剝離深度是通過膠帶粘貼次數(shù)來確定的。人們曾假設(shè)，重復(fù)粘貼膠帶可能會去除恒定數(shù)量的角質(zhì)層，與已經(jīng)粘貼的次數(shù)無關(guān)。因此，每次的膠帶剝離深度可以通過將角質(zhì)層總平均厚度除以膠帶總數(shù)量來計(jì)算。但實(shí)際研究表明，最初的膠帶粘貼去除的角質(zhì)量比后續(xù)的膠帶粘貼要多。因此，這一假設(shè)的有效性受到了質(zhì)疑，并引入了相關(guān)替代方法：例如通過稱重差異或蛋白測定法（BCA）來單獨(dú)測定每個膠帶粘貼上的角質(zhì)層量。但這些方法耗時(shí)，并且（在后一種情況下）具有破壞性。因此，無法在同一條膠帶上確定藥物量和角質(zhì)層中的深度。

為此，本文介紹的優(yōu)化方法應(yīng)運(yùn)而生。方法通過結(jié)合紅外光密度測定（IR-D）和冷凍切片技術(shù)，可高效獲取藥物在皮膚各層的濃度 - 深度分布曲線，為藥物配方篩選、滲透動力學(xué)研究提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

研究方法解析

皮膚厚度測量方法

準(zhǔn)確測量皮膚總厚度和角質(zhì)層厚度是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。皮膚總厚度測量采用卡尺法：將皮膚樣本置于載玻片上，覆蓋蓋玻片后，使用經(jīng)校準(zhǔn)的卡尺在 5 個不同位置進(jìn)行測量，取平均值作為總厚度。這種方法操作簡單，能快速獲取整體皮膚厚度數(shù)據(jù)。

角質(zhì)層厚度測量則需結(jié)合組織切片與顯微鏡技術(shù)。具體步驟為：取 4mm 直徑的皮膚活檢樣本，經(jīng) Tissue-Tek® 包埋后，用冷凍切片機(jī)切成 10μm 厚的切片；切片經(jīng)蘇木精染色增強(qiáng)對比度后，使用配備刻度標(biāo)尺和圖像分析軟件的光學(xué)顯微鏡（400×）進(jìn)行觀察，在至少 10 個不同區(qū)域測量角質(zhì)層厚度并取均值。該方法可精準(zhǔn)區(qū)分角質(zhì)層與其他皮膚結(jié)構(gòu)，確保厚度數(shù)據(jù)的特異性。

角質(zhì)膠帶剝離方法

（Labodorf 850C皮膚角質(zhì)量測量儀）

膠帶剝離技術(shù)是分離角質(zhì)層的金標(biāo)準(zhǔn)，其原理是利用膠帶的粘性逐層去除角質(zhì)層細(xì)胞及細(xì)胞間脂質(zhì)。本研究采用的方法有效提升了實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化程度。由可固定的壓模、含 cork 圓盤的鋁塊和 2kg 砝碼組成，配合 15mm 直徑的聚四氟乙烯掩膜，可精確定義剝離區(qū)域（面積約 1.77cm2）。

將剝離膠帶裁剪為 19×19mm 規(guī)格。操作流程嚴(yán)格規(guī)范：皮膚樣本固定于 cork 圓盤后，每次將膠帶中心對準(zhǔn)剝離區(qū)域，施加 2kg 壓力保持 10s，隨后快速揭下膠帶。通過 850 皮膚角質(zhì)量測試儀測量達(dá)到定量下限（LLOQ）后，即膠帶吸收值降至空膠帶 5 倍背景噪音水平，此時(shí)判定角質(zhì)層已去除。

紅外光密度測定在剝離后立即進(jìn)行，通過校正空膠帶背景吸收（xi = xi* - x0），可量化每個膠帶樣本上的角質(zhì)量。該方法具有快速、非破壞性優(yōu)勢，已通過與 BCA 蛋白測定法的相關(guān)性驗(yàn)證，確保數(shù)據(jù)可靠。

深層皮膚冷凍切片技術(shù)

去除角質(zhì)層后的剩余皮膚需進(jìn)行冷凍切片以研究深層皮膚（DSL）的藥物分布。樣本經(jīng)二氧化碳快速冷凍后，用 13mm 直徑打孔器獲取活檢組織，通過自制鋁制冷凍塊固定于冷凍切片機(jī)。切片方向平行于皮膚表面，厚度設(shè)定為 25μm，按預(yù)設(shè)方案合并為不同樣本組（如 “#7 組：2 個切片，#8 組：4 個切片” 等），并稱重記錄。

冷凍切片技術(shù)的關(guān)鍵在于快速冷凍以阻止藥物擴(kuò)散，同時(shí)通過精確控制切片厚度和方向，保證深層皮膚層劃分的準(zhǔn)確性。二氧化碳冷凍因速度快，但需注意不適用于揮發(fā)性藥物。

藥物提取與定量方法

藥物提取效率直接影響結(jié)果準(zhǔn)確性，需根據(jù)藥物性質(zhì)選擇合適的提取介質(zhì)。實(shí)驗(yàn)建議通過質(zhì)量平衡驗(yàn)證提取效果：對所有接觸藥物的裝置部件進(jìn)行提取，確保總回收率在 85%-115% 之間。提取流程包括：樣本中加入 2mL 提取介質(zhì)，振蕩 2h 后，以 5000rpm（800×g）離心 30min，取上清液進(jìn)行定量分析（如 HPLC）。

提取介質(zhì)的選擇需避免溶解膠帶膠黏劑或皮膚成分，以防干擾色譜分析或損壞儀器。對于膠帶樣本，可加入玻璃珠防止膠帶粘連，進(jìn)一步提升提取效率。

數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析

角質(zhì)層深度與濃度計(jì)算

吸收值校正與合并：單個膠帶的校正吸收值為 xi = xi* - x0，某一膠帶組的總吸收值 xpool (n) 為該組內(nèi)所有膠帶 xi 的總和。

相對厚度計(jì)算：通過 xpool (n) 與總吸收值 Xnmax 的比值，得到該組剝離角質(zhì)層的相對厚度 drel (n)* = xpool (n)/xnmax。

絕對厚度換算：結(jié)合預(yù)先測得的總角質(zhì)層厚度 dtot，計(jì)算各組絕對厚度 dn* = dtot × drel (n)*。深度與濃度計(jì)算：累計(jì)各組厚度得到角質(zhì)層深度；藥物濃度通過公式 cn = (cExn × VEx)/(AT × dn*) 歸一化，其中 AT 為剝離面積，VEx 為提取體積。

深層皮膚數(shù)據(jù)處理

切片厚度計(jì)算：根據(jù)各組皮膚切片重量 wk 與總重量 WNmax 的比值，結(jié)合總皮膚厚度 Ltot，得到各組絕對厚度。

深度與濃度計(jì)算：累計(jì)厚度得到深層皮膚深度；藥物濃度 cl = (cExl × VEx)/(AC × Ll*)，其中 AC 為冷凍切片面積（1.327cm2）。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

將歸一化后的藥物濃度與對應(yīng)皮膚深度作圖，可直觀呈現(xiàn)藥物在角質(zhì)層和深層皮膚中的分布特征。例如，案例顯示藥物在角質(zhì)層淺層濃度較高，隨深度增加逐漸降低，而在深層皮膚中呈現(xiàn)特定的分布趨勢，這為分析藥物滲透路徑和儲留形成提供了直接依據(jù)。

藥物滲透濃度與皮膚深度實(shí)驗(yàn)案例：

剝離面積 AT：1.77cm2

冷凍切片面積：1.33cm2

提取體積 VEx：2ml

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

皮膚樣本處理：推薦使用腹部整形手術(shù)獲取的皮膚，需簽署知情同意書；樣本在 - 26°C 儲存不超過 6 個月，避免反復(fù)凍融；皮下脂肪組織不得接觸角質(zhì)層，以防脂質(zhì)污染。

操作規(guī)范：膠帶需用鑷子夾持非測量區(qū)域，避免污染；剝離壓力嚴(yán)格控制為 2kg，時(shí)間為 10 秒，確保每次操作一致性；冷凍切片前需確認(rèn)皮膚表面平整，提升切片質(zhì)量。

安全與質(zhì)量控制：生物樣本操作需遵守安全規(guī)范；提取介質(zhì)需驗(yàn)證無干擾；實(shí)驗(yàn)記錄應(yīng)包括皮膚捐獻(xiàn)者信息、儲存時(shí)間等關(guān)鍵參數(shù)，保證結(jié)果可追溯。

特殊情況處理：水性介質(zhì)可能導(dǎo)致表皮脫落，需縮短孵育時(shí)間；揮發(fā)性藥物避免使用二氧化碳冷凍；樣本可在 - 26°C 短期儲存，但需盡快提取分析。

結(jié)語

本方法通過整合膠帶剝離、冷凍切片和紅外光密度測定技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了藥物在皮膚各層分布的精準(zhǔn)分析，可為制藥研發(fā)提供多方面支持：

·       配方優(yōu)化：比較不同載體對藥物皮膚分布的影響，指導(dǎo)制劑處方設(shè)計(jì)；

·       滲透動力學(xué)研究：通過不同孵育時(shí)間點(diǎn)的 profiles 分析，闡明藥物穿透規(guī)律；

·       安全性評估：檢測藥物在皮膚中的蓄積分布情況，評估潛在安全性風(fēng)險(xiǎn)；

·       機(jī)制探討：揭示藥物滲透路徑（如細(xì)胞間 vs 細(xì)胞內(nèi)）及蓄積形成機(jī)制。

隨著經(jīng)皮給藥技術(shù)的發(fā)展，該方法有望進(jìn)一步與成像技術(shù)（如 Raman 光譜、質(zhì)譜成像）結(jié)合，實(shí)現(xiàn)更高分辨率的藥物分布分析。同時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)化操作流程的建立將提升不同實(shí)驗(yàn)室間數(shù)據(jù)的可比性，推動經(jīng)皮給藥研究的規(guī)范化發(fā)展，為創(chuàng)新藥物和制劑的開發(fā)提供有力的實(shí)驗(yàn)工具，助力提升藥物研發(fā)效率與質(zhì)量。在實(shí)際應(yīng)用中，需根據(jù)具體藥物特性靈活調(diào)整實(shí)驗(yàn)參數(shù)，確保方法適用性，最終為臨床用藥安全有效提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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