逆轉錄PCR實驗重要要素詳解

       RT-PCR 就是逆轉錄 PCR（reverse transcription PCR）或者稱反轉錄 PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶鏈式反應（PCR）的一種廣泛應用的變形。在 RT-PCR 中，一條 RNA 鏈被逆轉錄成為互補 DNA，再以此為模板通過 PCR 進行 DNA 擴增。逆轉錄（reverse transcription）是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程，即 RNA 指導下的 DNA 合成，逆轉錄實驗包括3大要素，分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板：

1. 引物：逆轉錄引物主要有3種，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特異性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20個 T 堿基，并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對，可合成全長的 cDNA，但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ，對模板質量要求高，較適合克隆實驗。而 Random Primers 具有6-9個堿基，可隨機識別模板并結合，適合復雜結構和微量模板，但特異性低，小片段多，適合后續 qPCR 實驗。基因特異性引物可以識別特定模板序列，具有特異性強，靈敏度高的特點，但需合成特定的序列。所以根據不同實驗需求可進行相應引物的選擇。

2. 逆轉錄酶：一種是來自純化的禽成髓細胞瘤病毒（AMV），由兩條肽鏈組成，具有聚合酶活性和很強的 RNaseH 活性，它最適溫度是42℃，最適 pH8.3，在高反應溫度時可消除 mRNA 的二級結構對逆轉錄的阻礙，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產生也限制其長度。另一種來源于鼠白血病病毒（M-MLV），是單肽鏈的，有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性，最適溫度37℃，最適 pH7.6，較弱的  RNaseH 活性對獲得2-3kb的 mRNA 的全長 cDNA 有很大好處。

3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度計檢測純度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度，完整的總 RNA 在進行瓊脂糖凝膠電泳時會產生清晰的28S 和18S rRNA 條帶（真核樣品），28S rRNA  條帶的強度應當大致為18S rRNA 條帶的兩倍，并且無 gDNA 和蛋白殘留。